MAKALAH MIKROBIOLOGI PANGAN ASAL HEWAN
PERKEMBANGAN TERKINI DETEKSI TOKSIN BAKTERI
BERDASARKAN UJI ANTIBODI
MONIKA D. ANDRIANI B251140011
CHOLILIA ABADIATUL MASRUROH B251140021
PROGRAM
STUDI KESEHATAN MASYARAKAT VETERINER
SEKOLAH
PASCASARJANA
INSTITUT
PERTANIAN BOGOR
2014
PENDAHULUAN
Latar
Belakang
Analisis
toksin bakteri yang akurat dan terpercaya sangat penting dalam diagnostik
klinik, analisis makanan, pemantauan air, maupun sebagai tujuan biosekuriti untuk menghindari potensi berbahaya terhadap manusia dan hewan. Toksin
bakteri secara umum dikategorikan ke dalam eksotoksin (rantai peptide dan
protein) yang
diproduksi oleh bakteri patogen Gram positif maupun Gram negatif dan endotoksin
(LPS/ lipopolisakarida) yang
diproduksi oleh bakteri Gram negatif saja. Toksin tersebut secara luas mencakup
berat molekuler, antara < 1000 Da hingga >100000 Da, perbedaan kandungan
fisikokimia, dan penyebab berbagai gejala klinik. Berdasarkan target mereka,
eksotoksin digolongkan ke dalam toksin yang berperan terhadap permukaan sel
host dan toksin yang aktif secara intraseluler (Argrudin et al. 2010).
Terdapat banyak metode yang
telah dikembangkan dalam beberapa dekade terakhir untuk mencapai deteksi yang selektif
dan sensitif terhadap
toksin bakteri, yakni meliputi
pendekatan Direct dan Indirect Method. Pada satu sisi, toksin-toksin tersebut
secara langsung ditangkap oleh antibodi, atau diperkirakan dengan spektrometri
massa.
Selain itu, berbagai fungsi toksin digunakan untuk memicu efek pada hewan
atau sel, serta
spesies bakteri atau gen bakteri penghasil toksin yang dapat dideteksi. Uji secara
tidak langsung (indirect) dapat
memberikan informasi penting, khususnya ketika mencari toksin bakteri yang
tidak diketahui atau ketika uji secara langsung (direct) tidak tersedia (Senesei et
al. 2010). Dalam hal ini, pengetahuan mengenai pengujian tersebut sangat
penting karena merupakan salah satu cara untuk memahami bakteri secara lanjut.
Rumusan
Masalah
Permasalahan
yang akan dibahas dalam makalah ini adalah bagaimana cara mendeteksi toksin
bakteri baik secara langsung maupun tidak langsung.
Tujuan
Pembuatan makalah ini bertujuan untuk
memahami uji-uji dalam mendeteksi toksin bakteri baik secara langsung maupun
tidak langsung.
TINJAUAN
PUSTAKA
Toksin
Bakteri
Mikroorganisme
menyebabkan infeksi
dengan menghasilkan sejumlah molekul yang disebut faktor virulen. Mikroba patogen berbeda yang
mensintesis toksin pada awalnya dikenal sebagai faktor primer virulen yang
berdampak terhadap metabolisme dan menyebabkan kerusakan pada sel eukariot,
selanjutnya dalam kurun waktu yang lama akan berdampak secara letal terhadap
host. Berbagai gejala yang berhubungan dengan beberapa penyakit, seperti
dipteria, batuk, kolera, dan disentri, semuanya berhubungan dengan aktifitas
toksin yang diproduksi oleh bakteri (Payne et
al. 2013).
Toksin bakteri
mengakibatkan sel host mudah diserang dengan berbagai aksi, yaitu dengan merusak membran sel, menghambat
sintesis protein, aktivasi respon sistem imun yang menyebabkan kerusakan
seluler, menyebabkan
sel lisis secara langsung, dan memfasilitasi penyebaran bakteri melalui
jaringan (Payne et al. 2013).
Organisme seperti Clostridium difficile,
Corynebacterium diphtheria, dan Pseudomonas aeruginosa mensekresi
toksin yang dapat meningkatkan berbagai jalur patogenesis pada suatu penyakit.
Toksin dari C. difficile, sebagai
contoh, menyebabkan toksisitas seluler melalui Glukosilasi protein G Rho dan
ribosilasi ADP pada aktin, sedangkan toksin C.
diphtheria, dan P. aeruginosa
mengkatalis transfer ADP ribose ke faktor kedua perpanjangan (Elongation) untuk menghambat sintesis
protein sel, menyebabkan kematian pada sel target. Toksin TcdB dari C. difficile
menginaktivasi small GTPase Rho, Rac, dan Cdc42, dimana telah dilaporkan memicu kematian sel melalui
apoptosis (Voth, Ballard 2005).
Menurut Kayser et al. (2005), toksin bakteri dibagi menjadi dua, yaitu:
1. Eksotoksin
Eksotoksin merupakan toksin yang dikeluarkan dari
tubuh bakteri. Beberapa bakteri penghasil eksotoksin ialah Corynebacterium diphteriae,
Shigella dysentriae, Clostridium tetani, Clostridium botolium, Clostridium elcbii, Vibrio Chlorea, dan beberapa strain Escherichia coli. Eksotoksin yang dikeluarkan oleh bekteri-bakteri
tersebut menyebar melalui aliran darah ke seluruh tubuh yang dinamakan toksemia. Sifat dari jenis toksin ini
antara lain:
mudah dilarutkan dalam air, termasuk dalam golongan protein, bersifat
termolabil (jika dipanaskan pada suhu 56˚C, maka kekuatan toksin tersebut
berkurang), jika diinduksikan dalam tubuh, maka tubuh dapat memproduksi
antitoksin.
2. Endotoksin
Endotoksin adalah toksin yang dikeluarkan dari sel
bakteri, namun tetap diproduksi dan disimpan di dalam sel bakteri. Sifat umum dari endotoksin adalah termostabil (tahan terhadap
pemanasan), menyebabkan sakit dengan gejala-gejala yang sama sehingga tidak
spesifik, dan ada
periode inkubasi terhadap tubuh yang terkena toksin ini. Endotoksin termasuk
toksin yang sangat sulit dalam pendeteksiannya, dimana toksin tidak akan
terdeteksi sebelum bakteri penghasilnya masih hidup. Oleh karena itu, sel-sel
bakteri harus dimatikan terlebih dahulu sehingga materi-materi (termasuk
endotoksin) dari bakteri dapat terpisah dari sel bakteri.
Selain penggolongan tersebut, terdapat pula bermacam-macam
toksin bakteri yaitu:
1. AB
Toxins
Toksin ini
meliputi subunit “B” pengikat (binding
subunit B) yang berperan dalam pengikatan permukaan reseptor pada sel host,
dan subunit “A” pengkatalis sebagai agen pengaktivasi. Hanya sel yang
memperlihatkan reseptor B yang dapat dirusak oleh toksin jenis ini. Toksin AB
ini dihasilkan oleh
tiga jenis bakteri yaitu, Corynebacterium
diphteriae penghasil toksin diptera, Vibrio
cholera penghasil toksin kolera, dan Clostridium
tetani sebagai penghasil toksin tetanus.
2. Membrane Toxins
Toksin membran
merupakan jenis toksin yang mengganggu sistem biologis membran sel, baik dengan
merusak membran lalu berkumpul untuk membentuk pori-pori, atau dalam bentuk
fosfolipase yang merusak struktur membrane secara enzimatik. Terdapat dua jenis
toksin yang tergolong dalam toksin membran meliputi Alpha toxin (diproduksi oleh Clostridium
perfingens) dan Lesteriolysin
(dihasilkan oleh Lysteria monocytogenes).
3. Superantigen Toxins
Toksin ini
disebut Toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1)
yang dihasilkan oleh Staphylococcus
aureus. Antigen tersebut menstimulasi limfosit T dan makrofag untuk
menghasilkan sitokin berbahaya dalam jumlah yang sangat banyak (Kayser et al. 2005).
Antibodi
dan Immunoassay
Inti dari
prinsip Immunoassay adalah pengenalan
secara spesifik terhadap target yang ditarik oleh antibodi, yang merupakan
kunci utama dalam setiap uji. Beberapa jenis antibodi telah diketahui sebagai antibodi
yang dapat menarik toksin bakteri. Antibodi menggambarkan glikoprotein yang
memproses dua ikatan jenis polipeptida berbeda. Kedua rantai cahaya dan rantai
berat memperlihatkan variable rantai cahaya (Variable of Light/ VL) dan rantai berat (Variable of Heavy/ VH) pada akhir amino mereka, dimana bagian sisa
dari polipeptida ditunjukkan oleh bagian tetap (Constant Heavy (CH) dan Constant
Light (CL)). Bagian kedua rantai tersebut mengandung bagian hipervariabel,
yang menggambarkan bagian pengikat antigen (Antigen
Binding Site) atau biasa disebut Paratope.
Setelah mengalami folding dan
kombinasi rantai cahaya dan berat, hipervariabel dari suatu immunoglobulin
menunjukkan struktur yang melengkapi bagian mirip molekul antigen, dimana yang
menggambarkan determinan antigen atau biasa disebut Epitope (Byrne et al.
2009).
Antibodi yang
diproduksi dalam sel hewan secara alami berupa antibodi poliklonal dan
disintesis serta disekresi oleh sel plasma, turunan dari berbagai limfosit B. Limfosit tersebut menyatu dengan
sel myeloma. Sel myeloma tersebut menyediakan gen untuk melanjutkan pembelahan
sel, sementara limfosit menghasilkan gen imunoglobin fungsional. Gabungan kedua
sel tersebut disebut sel hybrid atau hibridoma, dan setiap sel hibridoma
menghasilkan tiruan antibodi identik, seperti antibodi monoklonal (Akiyoshi et al. 2010).
Immunoassay lebih menekankan pada kopian
antibodi jenis immunoglobulin G (IgG). Setiap sel myeloma mengenali satu jenis
epitope, antibodi poliklonal dapat mengikat keberadaan epitope pada antigen
yang digunakan dalam imunisasi. Dalam penerapan khusus, enzim, seperti papain
dan pepsin, digunakan untuk membantu antibodi intak untuk menghasilkan fragmen
kecil pengikatan antigen (Zhu et al.
2014).
PEMBAHASAN
Immunoassay
Immunoassay meliputi tiga tahap penting,
yaitu:
1.
Pengenalan
target toksin oleh antibodi
2.
Subsekuen
transduksi signal
3.
Teknik
pembacaan sebagai hasil kualitatif atau kuantitatif.
Uji Kompetitif dan non-kompetitif
kemungkinan dapat digolongkan ke dalam langkah yang pertama, tergantung jumlah
epitope yang terdapat pada toksin. Metode kompetitif didasarkan atas kompetisi
dari antigen bebas dan dilabel atau ikatan yang erat antigen terhadap
terbatasnya keberadaan jumlah antibodi. Dalam banyak kasus, respon dari uji ini
menggambarkan ikatan antigen yang terlabel dan selanjutnya merupakan kebalikan
dari banyaknya konsentrasi antigen bebas. Uji jenis ini digunakan untuk deteksi
toksin dengan berat molekul kecil, seperti monocyclic
hepapetide, mikrosistin, yang diproduksi oleh
Cyanobakteri, dimana hanya memiliki satu epitope. Dua jenis uji nonkompetitif dapat
digunakan untuk mendeteksi protein toksin bakteri secara langsung. Uji yang pertama
disebut Sandwich Enzyme Immunoassay
hanya dapat
digunakan untuk mendeteksi makromolekul, seperti protein toksin, yang memiliki
paling sedikit dua posisi sterik berbeda, sehingga dua antibodi (antibodi
penangkap dan antibodi pendeteksi) mengikat toksin dari antigen. Sedangkan
jenis yang kedua, Solid phase diselubungi
oleh toksin secara langsung, dan jumlah ikatan toksin dideterminasi menggunakan
pelabelan antibodi spesifik. Dalam kedua kasus, respon uji ini adalah jumlah
antigen target secara langsung (Zhou et
al. 2014).
Pada langkah kedua, protokol
berbeda dapat digunakan untuk menghasilkan pembacaan akhir setelah pengikatan
antibodi primer. Dalam observasi yang sensitif
terhadap reaksi antigen-antibodi, antigen atau antibodi harus dilabel baik
secara langsung maupun tidak langsung. Pelabelan secara langsung termasuk
fungsionalisasi antibodi sekunder dan sistem biotin-avidin untuk menjembatani
reaksi antigen-antibodi dan keberadaan signal (Shlyapnikov et al. 2012).
Modifikasi secara langsung antibodi
primer dapat dilakukan dengan biomolekul, seperti Horseradish Peroxidase (HRP) atau Alkaline Phosphate (ALP), dan
dapat menghasilkan perununan afinitas dan stabilitas yang dihasilkan oleh efek
bagian yang tidak spesifik dari gabungan kimia dan/atau halangan sterik dengan
adanya enzim yang dapat melengkapi reaksi tersebut. Selanjutnya, modifikasi
oligonukleotida antibodi primer telah diimplemetasikan dalam metode immuno-PCR untuk mendeteksi toksin Shiga
2 (Stx2) dan jenis-jenis Stx2 (He et al. 2011).
Sementara, pada tahap ketiga, dimana
pembacaan akhir sangat dibutuhkan. Meskipun metode label-free, seperti Surface Plasmon Resonance (SPR) dan
sensor elektromagnetik, telah digunakan dalam pendeteksian toksin kolera dan
LPS bakteri Gram negatif dengan sensitifitas tinggi (El Ichi et al. 2014), secara luas immunoassay
memanfaatkan pelabelan imunoreagent. Signal tersebut dapat diamplifikasi
menggunakan enzim, yang secara luas digunakan untuk uji kuantitatif dan
kualitatif berdasarkan kolorimetri. Namun, deteksi sejumlah toksin terkadang
membutuhkan signal penunjang, dan banyak metode lain, seperti fluoresen,
luminesen, signal elektronik dan spektometri masa, telah diberlakukan untuk
meningkatkan sensitifitas (Zhu et al.
2014).
Gambar
1 Tahapan
Imunoassay: Reaksi
Antigen-antibodi (A,B), Tahap awal (Pengenalan toksin target
oleh Antibodi) Immunoassay (C), Tahap kedua (Subsequent signal transduction) Immunoassay (D), Tahap ketiga (Pembacaan hasil
kulaitatif atau kuantitatif) Immunoassay (E, F).
Nanomaterial
Immunoassay
Nanoteknologi
termasuk bioanalisis dan merupakan salah satu bagian dari teknologi yang
paling inovatif dan atraktif. Keragaman perbedaan ukuran, bentuk, dan komponen
fungsional Nanomaterial telah diketahui. Nanomaterial dapat digunakan secara
langsung dalam pembacaan atau secara tidak langsung sebagai penunjang pelabelan
lain, seperti probe enzim dan probe fluoresen.
Gold
Nanoparticles (AuNps)
Optical
immunoassays
didasarkan atas pewarnaan secara langsung yang dimediasi oleh AuNPs baik pada
permukaan padat atau dalam cairan.
Immunoassay terdahulu, sebagai contoh, secara khas dilakukan dalam
hidrofobic nitroselulosa dan membran selulosa acetat. Pada uji jenis sandwich, uji garis merah menunjukkan
keberadaan target, disebabkan oleh akumulasi deteksi antibodi yang dilabel
dengan AuNPs pada area uji. Selanjutnya, dalam perkembangannya, dual assay secara simultan dapat
mendeteksi neurotoksin botulinum serotype A dan B dalam satu strip. Dalam
pelabelan padat, setelah terjadi agregasi AuNPs melewati interaksi
elektrostatik tidak spesifik atau setelah diikat oleh antibodi, terjadi
perubahan drastic dari merah (partikel yang memudar) menjadi warna biru
(partikel agregat), dimana dapat digunakan untuk deteksi visualisasi atau
kuantifikasi. Sebagai contoh, toksin kolera subunit B (CTB) dapat mengikat
AuNPs secara spesifik yang dimodifikasi oleh turunan laktosa dan menginduksi
agregasi AuNPs, mengikuti deteksi toksin 54nM (3µg mL-1) (Jiang et al. 2013).
Magnetic Nanoparticles (MNPs)
Berdasarkan perkembangannya, metode
nanomaterial memiliki multifungsi berdasarkan inti partikel yang ada di
dalamnya, baik MNP dan Au atau silicon. Menariknya, MPN juga dapat digunakan
secara langsung sebagai deteksi pembacaan toksin. Lima toksin bakteri, termasuk
toksin kolera, toksin heat-labeled
Escherichia coli, enterotoksin A dan B dan TSST dari S. aureussecara simultan dapat dideteksi dalam imunoarray pada
sampel air, daging, dan susu (Zhu et al.
2014). Singkatnya, toksin-toksin tersebut muncul dengan adanya antibodi
spesifik yang menyelubungi toksin pada saat microarray dan selanjutnya dilabel
dengan antibodi deteksi biotinylated. Signal dari uji ini diperoleh dengan
scanning permukaan microarray menggunakan penyelubungan MB streptavidin. Uji
ultrasensitive ini dapat mendeteksi
toksin antara 0,1 hingga 1pg mL-1 dalam waktu kurang dari 10
menit, seperti 100 zeptomol atau 100000molekul toksin kolera dalam sampel
dengan volum 0,1 mL. Lebih lanjut, magnesisasi nonlinear MNP digunakan untuk
uji sandwich pada serat padat 3D untuk mendeteksi enterotoksin A Staphylococcus
(SEA) dan TSST dalam sampel susu (Orlov et
al. 2013). Uji pelabelan bebas ini hanya dapat mendeteksi 4pg mL-1
dan 20pg mL-1 TSST dan SEA. Antibodi bersatu dengan fluoresen
magnetik mikrosferdilakukan untuk deteksi multi toksin pada neurotoksin
botulinum tipe A dan B serta enterotoksin Staphylococcus tipe B (SEB) dan
toksin sejenis dalam uji suspensi (Pauli et
al. 2009).
Quantum Dots (QDs)
QDs merupakan nanokristal semikonduktor
yang telah dikembangkan dalam berbagai bidang, pertama kali dikenalkan sebagai
probe floresen dalam penerapan biomedik oleh dua laboratorium. Dibandingkan
dengan floresen kimia tradisional dan protein, QDs memberi beberapa keuntungan,
seperti spectrum eksitasi secara luas, hasil kuantum tinggi, dan fotostabilitas
yang tinggi. Sebagai contoh, immunoassay sandwich floresen untuk kuantifikasi
neurotoksin botolinum serotip A (BoNT/A) merupakan salah satu fungsi QDs dengan
afinitas antibodi yang tinggi. Kemudian, immunoassay kompetitif tidak langsung
telah dibangun untuk analisis mikrosistin LR dalam air. Karbon yang diselubungi
oleh QDs dipadukan dengan aminoetil mikrosistin LR dan digunakan sebagai donor
bersama dengan Cys5.5 yang dilabel
dengan antibodi sebagai reseptor untuk menciptakan sistem transfer energi
floresen (fluorescence resonance energy
transfer (FRET)) untuk deteksi secara sensitive dan cepat LR mikrosistin
dalam sampel air pada papan portable
optofluidic. Intensitas floresen dari QDs dilakukan dengan adanya LR
mikrosistin, dengan kemampuan deteksi 6,9 x 10-11 molL-1
toksin dalam sampel air (Zhu et al.
2014).
Carbon Nanomaterials
Nanomaterial karbon merupakan metode
nanoteknologi yang menarik perhatian, meliputi penerapan secara luas, dari
biosensing hingga drug delivery.
Dibandingkan dengan nanomaterial turunan metal, seperti AuNPs atau Kadmium
floresen QDs, nanomateri karbon menunjukkan biokompatibilitas yang bagus dan
ramah lingkungan. Nanomateri yang banyak digunakan termasuk fullerenes, carbon nanotube (CNTs), grapheme, carbon dots, nanodiamon, dan karbon nanofiber (Zhu et al. 2014).
Berdasarkan struktur intrinsiknya, CNTs
dapat dikategorikan ke dalam single-walled
carbon nanotubes (SWNTs) dan multiwalled
carbon nanotubes (MWNTs). CNTs digunakan secara langsung untuk deteksi
pelabelan bebas terhadap toksin epsilon dari Clostridium perfringens dengan batas deteksi sekitar 2nM dan genom
DNA Shiga-toxin dari E. coli. Selanjutnya, CNTs dimodifikasi
dengan antibodi plastik, laktosa, dan peptide-peptida yang dikembangkan untuk
deteksi mikrosistin, toksin kolera dan toksin antrak PA.
Sejak dikembangkan pertama kali pada
tahun 2004 tentang komponen eletrik grafin, berbagai penerapan telah dilah
dilaporkan. Sebagai contoh, grafin dan chitosan di-immobilisasi pada elektroda
untuk mendeteksi mikrosistin LR, dan konjugat antibodi karbon nanosfer HRP
digunakan sebagai signal amplifikasi. Pendekatan ini memiliki batas deteksi
mikrosistin LR sebanyak 0,016µg L-1 dalam sampel air lingkungan. Grapheme oxide (GO), material dengan
komponen super, telah digunakan secara luas untuk penerapan biomedik dan
kebutuhan analisis. Selama proses preparasi, komponen GO floresen, adalah
fenomena yang digunakan secara langsung untuk menguji mikrosistin. Penyerapan
antibodi pada lembar GO secara spesifik menggambarkan mikrosistin yang terikat
pada AuNPs, dengan floresen GO oleh FRET antara GO dan AuNPs. Dengan bantuan
spektrum tinggi antibodi untuk mikrosistin, dapat mendeteksi 0,5µg L-1
dan 0,3µg L-1 mikrosistin LR dan mikrosistin RR. Lebih lanjut,
penggunaan floresen GOs untuk pengujian platform biosensing yang berbeda.
Sistem FRET yang menggunakan microarray antibodi CdSe/ZnS QD untuk deteksi E. coli O157:H7 telah dilaporkan, dengan
QDs sebagai penerima transfer energi. GO berinteraksi dengan QDs melalui π-π stacking dan floresen dalam keadaan
tanpa bakteri, sementara QDs akan mengaktifkan floresen ketika terdapat bakteri
(Shi et al. 2012).
Gambar
2 Nanomaterial Immunoassays: (A). Gold Nanoparticles (AuNps),
(B). Magnetic Nanoparticles (MNPs), (C). Quantum Dots (QDs), dan
(D). Carbon Nanomaterials.
Micro Total Analysis System (µTAS)
Micro
Total Analysis System (µTAS) merupakan
metode yang dikenal sebagai lab(oratories)-on-a-chip
(LOC) dan alat microfluidic. Sistem pada metode ini berhubungan dengan
pengujian kimia dan biologi pada miniaturized
chip dalam skala sentimeter. Secara
umum, jenis uji ini dengan platform microfluidic digolongkan kedalam dua
golongan, yaitu:
1.
Chip
yang didesain untuk penggambaran uji tradisional, seperti ELISA
2.
Chip
yang berhubungan dengan sampel pretretmen, amplifikasi signal, dan teknik
pembacaan.
Sandwich dan kompetitif dari ELISA
dikombinasikan dengan alat microfluidic untuk meneliti sel tunggal dalam
mengidentifikasi keberadaan protein intraseluler dan metabolit. Platform
tersebut meliputi semua langkah analisis sel tunggal dari sel lisis ELISA,
termasuk waktu inkubasi, langkah pengulangan dalam pencucian, dan pembacaan
floresen. Sebuah ELISA microfluidic bekerja dalam membran semipermeabel
terhadap prekonsentrasi target yang dianalisis oleh rata-rata elektromagnetik.
Konsentrasi lokal
dalam analisis dalam membran visinitas menghasilkan 200-fold dari peningkatan signal
ELISA, dimana signal background meningkat hanya 2 ikatan. Selanjutnya, hanya 5µL
dari sampel yang dibuthkan untuk dibandingkan dengan 100µL ELISA (Yanagisawa et al. 2012).
Dalam sebuah
penelitian, dilakukan kombinasi terhadap 8 chip channel dan satu SWNT yang berdasar
atas immunoassay untuk deteksi SEB. Antibodi Rabbit anti-SEB di-imobilisasi
pada SWNTs. Signal tersebut akan ditangkap dengan peningkatan chemiluminesen
yang dapat mendeteksi 0,1ng mL-1 SEB dalam 10µL sampel. Lebih
lanjut, platform microfluidic ini ditingkatkan dengan deteksi pelabelan dan
dikondisikan dalam “Biological
Semiconductor”. Kombinasi impedimetric imunosensor dengan chip microfluidic
telah digunakan terhadap toksin kolera subunit B. Peningkatan impedance secara langsung berhubungan
dengan ikatan toksin pada permukaan elektroda, dan toksin dengan tingkat rendah
1ng mL-1 dapat dideteksi (Chiriaco et al. 2011).
Gambar
3 (A): [a]. Layout
Biochip, [b]. Skema cara kerja elektroda, dan [c]. Spektrum Nyquist pada toksin
kolera dengan konsentrasi berbeda. (B): [a]. Skema kompetisi immunoassay dalam reaksi imun,
dan [b]. Ilustrasi cara kerja chip pada immunoassay.
Metode
Baru
Kecocokan
terhadap probe floresen dalam potensi penerapan di bidang biologis telah dibuat
dalam berbagai jenis pengembangan bahan-bahan. Di antara bahan-bahan tersebut,
probe floresen aggregation-induced
emission (AIE) telah dikembangkan untuk mendeteksi molekul kecil, DNA, dan
protein. Keberadaan AIE memberikan respon floresen turn-on dalam agregat yang berlawanan dengan probe yang biasa dipakai
yaitu aggregation-caused quenching
(ACQ) dengan sensitivitas lebih tinggi dan lebih akurat. Kombinasi probe AIE
dengan nanomaterial, misalnya GO, dan bahan mesoporous menunjukkan hasil yang
sangat bagus dalam sensing target yang spesifik. Sebagai contoh, AIE-based aptasensor menggunakan aptamer sebagai elemen pengenal dan GO
sebagai platform penyerap yang efisien telah dilakukan untuk deteksi DNA target dan Thrombin. Dalam
hal yang sama, konjugasi probe AIE dengan antibodi spesifik dan berbagai nanomaterial
dapat memberikan peluang terhadap sensitivitas dan selektif immunoassay untuk deteksi
bermacam-macam toksin bakteri (Li et al.
2014).
Dibandingkan
dengan kemampuan immunoassay dalam channel microfluidic, sistem digital microfluidic (DMF) selalu
popular, dimana pendekatan ini sebagai alternatif droplet dengan permukaan
terbuka berdasar atas sistem cair. Dalam sistem DMF, fluidic dikontrol secara
elektrostatis dalam droplet tersendiri, dalam ukuran picoliter hingga
microliter, terhadap sebuah uji insulator hidrofobik yang diselubungi
elektroda. Pemisahan droplet dapat dimanipulasi untuk mencampur, memisahkan,
dan menghilangkan kebutuhan akan minyak. Manfaat tersebut membuat DMF merupakan
sistem yang cocok bagi immunoassay baik yang kompetitif maupun non-kompetitif.
Suatu sistem otomatis telah dikembangkan untuk melengkapi immunoassay dari
penerapan sampel terhadap pembacaan optikal dengan cara manual. Sebuah desain
pengujian tiga faktorial (DOE) telah diimplementasikan untuk optimalisasi
konsentrasi dan volume sampel serta waktu inkubasi terhadap peningkatan
sensitivitas uji sandwich. Sementara itu, platform DMF penunjang immunoassay
dan deteksi elektrokimia juga telah dikembangkan. Konjugasi magnetic
mikropartikel antibodi primer digunakan untuk menangkap target, dan antibodi
sekunder yang dilabel dengan HRP mengkatalis substrat pada pengujian
ampermetrikal (Zhu et al. 2014).
Sebuah penelitian mengenalkan
immunoassay kromatografik yang disebut dengan alat diagnostic berdasar paper.
Paper tersebut dikenalkan sebagai substrat untuk alat microfluidic dalam test
diagnostic secara cepat, yaitu microfluidic
paper analytical device (µPAD). Metode tersebut memberikan beberapa manfaat
sebagai polymer polydimethylsiloxane (PDMS)
atau stik poly(methyl methacrylate) (PMMA).
Mereka dapat dengan mudah didesain dan dibuat menggunakan barrier hidrofobik
(lilin atau udara) dan cocok dengan larutan hidrofilik dan sampel dengan volume
kecil. µPAD hanya membutuhkan waktu beberapa menit dan hampir tidak membutuhkan
perlengkapan khusus. Manfaat-manfaat membuat µPAD cocok point-of-care testings (POCTs) dan penerapan dalam situasi minim
sumber. Selain itu, bahan-bahan lain yang mudah dipakai, seperti polypropilen,
telah digunakan untuk menunjang deteksi immunoassay multiple protein. Uji
imunokromatografik sandwich prinsip
mirip benang dalam aliran immunoassay kromatografik untuk target tunggal (Zhu et al. 2014).
Analisis toksin abketri paling popular
merupakan perkembangan metode analisis multiplek, dalam beberapa contoh telah
dilaporkan. Uji-uji tersebut dapat dikategorikan ke dalam tiga kelompok:
1.
Uji
yang dilarutkan secara spectrum, seperti immunoassay QDs berbeda atau signal
yang berhubungan dengan enzim
2.
Uji
yang dilarutkan secara spasial, seperti SPR dan mikroassay
3.
Uji
yang dialrutkan secara berkala, seperti HPLC, dan
4.
Uji
yang dilarutkan dnegan molekul, seperti MALDI-TOF.
Teori matematika dalam uji-uji tersebut
berawal dari model one-to-one (M=N),
dimana M bermakna faktor multipleks dan N bermakna jumlah target. Dalam sebuah
penelitian, uji immunoassay berdasar
OR dikembangkan untuk deteksi secara simultan pada tujuh komponen protein
toksin Bacillus cereus (Rajagopal et al. 2013).
Gambar 4 (A). [a]. Sintesis probe AIE
(9,10-dystyrylanthracene dengan dua grup ammonium, DSAI), [b]. Skema penjelasan
floresen selektif berdasar aptasensor pada probe DSAI/GO. (B). Skema langkah
dalam elektroimunoessay DMF, (C). Uji Imunokromatografi, dan (D). jenis utama
uji deteksi toksin bakteri dalam plate
microtiter.
SIMPULAN
Deteksi toksin bakteri menggunakan
antibodi menjadi pendekatan yang sukses dalam beberapa dekade. Pengujian di
masa depan sulit dapat digambarkan tanpa penggunaan antibodi sebagai elemen
pengenal. Perkembangan terkini dalam teknik antibodi akan sangat membantu dan
memfasilitasi integrasi antibodi atau fragmen antibodi ke dalam format uji yang
baru.
DAFTAR
PUSTAKA
Akiyoshi DE,
Sheoran AS,
Rich CM, Richard L, Chapman-Bonofiglio S, Tzipori S. 2010. Evaluation of
Fab and
F(Ab')2 Fragments and Isotype Variants of
a
Recombinant Human Monoclonal Antibody Against Shiga Toxin 2. Infect. Immun,
78:1376–1382.
Argudin MA,
Mendoza MC, Rodicio MR. 2010. Food
Poisoning and
Staphylococcus aureus Enterotoxins. Toxins,
2:1751–1773.
Byrne B,
Stack E, Gilmartin N, O’Kennedy R. 2009.
Antibody-Based Sensors: Principles, Problems and
Potential For Detection Of Pathogens And Associated Toxins. Sensors, 9:4407–4445.
Chiriaco MS,
Primiceri E,
D'Amone E, Ionescu RE, Rinaldi R, Maruccio G. 2011. EIS Microfluidic Chips for Flow
Immunoassay and Ultrasensitive Cholera Toxin Detection. Lab. Chip, 11:658–663.
El
Ichi S, Leon F,
Vossier L,
Marchandin H,
Errachid A, Coste J, Jaffrezic-Renault N,
Fournier-Wirth C. 2014. Microconductometric
Immunosensor for Label-free and Sensitive Detection of Gram-negative Bacteria. Biosens.
Bioelectron, 54:378–384.
He
X, Qi W, Quinones B,
McMahon S, Cooley M, Mandrell RE. 2011.
Sensitive Detection of Shiga Toxin 2 and Some of Its Variants in
Environmental Samples by a Novel Immuno-PCR Assay. Appl. Environ. Microbiol,
77:3558–3564.
Jiang S,
Win KY, Liu S, Teng CP,
Zheng Y, Han MY. 2013. Surface
Functionalized Nanoparticles for Biosensing and Imaging-guided Therapeutics. Nanoscale,
5:3127–3148.
Kayser FH,
Bienz KA, Eckert J, Zinkernagel RM. 2005. Medical
Microbiology. New York: Thieme.
Li
X, Ma K, Zhu S, Yao S, Liu Z, Xu B, Yang B, Tian W. 2014. Fluorescent Aptasensor Based on Aggregation-Induced
Emission Probe and Graphene Oxide. Anal. Chem., 86:298–303.
Orlov
AV, Khodakova JA, Nikitin MP, Shepelyakovskaya AO, Brovko FA, Laman AG, Grishin
EV, Nikitin PI.
2013. Magnetic Immunoassay for
Detection of Staphylococcal Toxins in Complex Media. Anal. Chem., 85:1154–1163.
Pauly D,
Kirchner S,
Stoermann B, Schreiber T, Kaulfuss S, Schade R, Zbinden R,
Avondet MA, Dorner MB, Dorner BG. 2009.
Simultaneous Quantification of Five Bacterial and Plant Toxins from Complex
Matrices using a multiplexed Fluorescent Magnetic Suspension Assay. Analyst
134:
2028–2039
Payne AM,
Zorman J, Horton M, Dubey M, ter
Muelen J,
Vora KA. 2013. Caspase Activation as a Versatile Assay Platform for Detection
Cytotoxic Bacterial Toxins. J. Clin.
Microbiol. Vol. 51, No. 9:2970-2976.
Rajagopal
A,
Scherer A,
Homyk A,
Kartalov E. 2013. Supercolor
Coding Methods for Large-Scale Multiplexing of Biochemical Assays. Anal.
Chem., 85:7629–7636.
Senesi S,
Ghelardi, E. 2010. Production,
Secretion and
Biological Activity Of Bacillus Cereus Enterotoxins. Toxins, 2:1690–1703
Shi Y,
Wu J, Sun Y, Zhang Y,
Wen Z, Dai H,
Wang H, Li Z. 2012. A Graphene
Oxide Based Biosensor for Microcystins Detection by Fluorescence Resonance
Energy Transfer. Biosens. Bioelectron., 38:31–36.
Shlyapnikov
YM, Shlyapnikova EA, Simonova MA, Shepelyakovskaya AO, Brovko FA, Komaleva RL,
Grishin EV, Morozov VN.
2012. Rapid Simultaneous Ultrasensitive
Immunodetection of
Five Bacterial Toxins. Anal. Chem., 84:5596–5603.
Voth DE, Ballard JD. 2005. Clostridium Difficile Toxins:
Mechanism of
Action and
Role in
Disease. Clin. Microbiol. Rev. 18:247–263.
Yanagisawa
N, Dutta D. 2012.
Enhancement in
The Sensitivity of
Microfluidic Enzyme-Linked Immunosorbent Assays Through Analyte
Preconcentration. Anal. Chem., 84:7029–7036.
Zhu
K, Dietrich R, Didier A, Doyscher D, Martlbauer E. 2014. Recent
Developments in Antibody-Based Assays for the Detection of Bacterial Toxins. Toxins. 6:1325-1348.
LAMPIRAN
Tabel 1. Overview
Perkembangan Metode Deteksi Toksin Bakteri
|
Assay
|
Jenis
|
Keterangan
|
Jenis toksin yang dideteksi
|
||
|
Immunoassay
|
Pengenalan
target toksin oleh antibodi
(Competitive
and noncompetitive immunoassay)
|
Monocyclic hepapeptide
|
Deteksi toksin dengan berat molekul kecil
|
Mikrosistin
(Cyanobacteria)
*hanya memiliki satu epitop
|
|
|
Sandwich
Enzyme Immunoassay
|
Deteksi toksin dengan berat molekul besar
|
Toksin yang meiliki paling sedikit 2 epitope
|
|||
|
Solid
phase
|
Deteksi dengan penyelubungan toksin dengan
antibodi spesifik
|
|
|||
|
Subsekuen
transduksi signal
(pelabelan antibodi
primer atau sekunder)
|
Horseradish
Peroxidase (HRP) atau Alkaline Phosphate (ALP)
|
Pelabelan
menggunakan enzim
|
|
||
|
Immuno-PCR
|
Pelabelan menggunakan antibodi primer
oligonukleotida
|
Toksin Shiga
2 (Stx2)
|
|||
|
Teknik pembacaan sebagai hasil kualitatif atau
kuantitatif
|
Fluorescence, luminescence, electrical
signal, and mass spectometry
|
Berguna untuk
meningkatkan sensitifitas pengujian
|
|
||
|
Nanoteknologi
|
Optical
immunoassays
|
Gold
Nanoparticles (AuNps)
|
Fluidic
|
Menggunakan hidrofobic
nitroselulosa dan membran selulosa acetat
|
Neurotoksin botulinum serotipe A dan B
|
|
Solid
|
·
Terjadi
perubahan warna secara drastis karena adanya agregasi AuNPs melewati interaksi
elektrostatik tidak spesifik
·
Digunakan sebagai deteksi
visualisasi dan kuantifikasi
|
Toksin kolera subunit B (CTB)
|
|||
|
Ultrasensitive assay
|
Magnetic Nanoparticles (MNPs)
|
|
·
Toksin-toksin muncul dengan
adanya antibodi spesifik yang menyelubungi toksin
·
Dapat mendeteksi toksin antara 0,1 hingga 1pg mL-1
dalam waktu kurang dari 10 menit
·
Sampel air, daging, dan susu
|
·
Toksin kolera,
·
Toksin heat-labeled Escherichia coli,
·
Enterotoksin A dan B, dan
·
TSST dari S. aureus
|
|
|
Nanoteknologi
|
Nanokristal semikonduktor
|
Quantum
Dots (QDs)
|
Solid
(sandwich)
|
Direct
assay secara kuantitatif
|
Neurotoksin
botolinum serotip A (BoNT/A)
|
|
Fluidic
|
· Indirect
assay portable optofluidic
· Bekerja
dengan sistem transfer energi flouresen (FRET)
· Sampel
air
|
Toksin LR mikrosistin
|
|||
|
|
Carbon Nanomaterial (CNTs)
|
Single-walled
carbon nanotubes
(SWNTs)
|
· Direct assay
· Menggunakan
plastic antibody, lactose, dan peptide
· Sampel air
lingkungan
|
· Toksin epsilon
dari Clostridium perfringens
· DNA Shiga-toxin dari E. coli
· Mikrosistin
· Toksin kolera,
dan
· Toksin Antrak
|
|
|
Multiwalled
carbon nanotubes
(MWNTs)
|
|||||
|
Micro Total Analysis System (µTAS)
|
Miniaturized
chip
|
Uji tradisional
|
ELISA
|
· Deteksi sel
tunggal dalam protein intraseluler dan metabolit
· Dilakukan pada
membran semipermeable
· Direct dan
indirect
|
· Toksin SEB
· Toksin kolera
subunit B
|
|
Pretreatment Chip
|
Pretretmen,
amplifikasi signal, dan teknik pembacaan
|
· Dilakukan
dengan kombinasi chip dan material lain seperti SWNT
· Dikondisikan
dalam Biological semiconductor
· Direct method
· Dapat
dilakukan pada toksin dengan tingkat rendah.
|
|||
|
Metode baru
|
Fluorescence probe
|
Aggregation induced emission (AIE)
|
· Sensitivitas
tinggi
· Akurasi tinggi
· Dilakukan konjugasi
probe AIE dengan antibodi spesifik dan berbagai nanomaterial
|
Berbagai macam toksin bakteri
|
|
|
Aggregation-caused quenching (ACQ)
|
|
||||
|
Optical readout
|
Digital
microfluidic (DMF)
|
· Konjugasi
magnetic mikropartikel antibodi primer
· Pelabelan
menggunakan antibodi sekunder HRP
|
|
||
|
Three-level factorial design of experiment (DOE)
|
· Sebagai
optimalisasi konsentrasi dan volume sampel serta waktu inkubasi untuk
meningkatkan sensitivitas uji sandwich
|
||||
|
Metode baru
|
Paper-based chromatography
|
Microfluidic
paper analytical device (µPAD)
|
Polymer
polydimethylsiloxane (PDMS)
|
· Didesain
menggunakan barrier hidrofobik namun cocok dengan larutan hidrofilik
· Sampel
bervolume kecil
· Hanya
membutuhkan waktu beberapa menit
|
Multiple Target (ptotein/toksin).
|
|
Poly(methyl
methacrylate) (PMMA)
|
|||||
|
Multiplex analysis (Mathematic-based theories)
|
Spectrally resolved assays
|
Penggunaan
enzim sebagai pembeda signal
QDs
|
· Direct
· Jumlah target
tidak terbatas
|
·
Berbagai macam toksin bakteri
·
Telah dilakukan peneltian tentang deteksi tujuh
macam toksin yang disekresi oleh B.
cereus
|
|
|
Spatially resolved assays
|
SPR and microarrays
|
||||
|
Temporally resolved assays
|
HPLC
|
||||
|
Molecule resolved assays
|
MALDI-TOF mass
spectrometry
|
||||
